Padronização da metodologia de Dot-Blot para o diagnóstico rápido da Paracoccidioidomicose

Resumo

 A paracoccidioidomicose (PCM), micose profunda de natureza crônica granulomatosa, apresenta maior incidência      no Brasil. O diagnóstico de certeza deriva da visualização do agente etiológico, o fungo Paracoccidioides spp em amostras biológicas. No entanto, em algumas situações o acesso ao local da lesão impede a coleta do material   biológico. Assim, as técnicas imunosorológicas permitem inferir diagnóstico com certo grau de certeza, otimizando  o tempo utilizado para se obter resultados. A técnica sorológica amplamente utilizada para o imunodiagnóstico da PCM é a imunodifusão dupla em gel de agarose (ID), com especificidade e sensibilidade variando de 65 a 100%;   sendo de fácil execução e não necessitando de automação. A técnica de Dot-Blot (DB) tem sido utilizada com sucesso   no diagnóstico de inúmeras doenças parasitárias e infecciosas, como a toxoplasmose e a leishmaniose visceral. No      diagnóstico da PCM, a metodologia mostrou-se promissora no acompanhamento de pacientes durante o tratamento      anti-fúngico e em inquéritos soroepidemiológicos. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi padronizar o ensaio      de Dot-Blot visando o diagnóstico rápido da PCM, propondo que o mesmo seja uma ferramenta de triagem dos soros      com suspeita clínica para a doença. A padronização da técnica de Dot-Blot apresentou melhores resultados quando se      utilizou antígeno obtido de filtrado de cultura de P. brasiliensis do isolado B-339 para a sensibilização de membranas      de nitrocelulose. As diluições de soro e conjugado foram de 1:40 e 1:2000, respectivamente, incubando ambos em      solução PBS-L 3%. Para a padronização do ensaio de Dot-Blot, 143 amostras de soro foram utilizadas e chamadas      de grupo controle. Destas, 23 amostras de soro foram de pacientes aparentemente sadios, 77 amostras de soro de      pacientes com PCM confirmada e 43 amostras de soros com outras doenças (tuberculose, aspergilose e histoplasmose).      A análise dos resultados possibilitou o cálculo dos valores de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e      negativo, prevalência e acurácia para ambas as técnicas isoladamente, sendo eles: 98,2%, 75,5%, 72,7%, 98,4%, 40% e      84,6% para a ID e 95,9%, 90%, 91%, 95,4%, 51% e 93% para DB, respectivamente. Além do grupo controle, mais 300   amostras de soro de pacientes apenas com a suspeita clínica da doença foram utilizadas para avaliar o desempenho da   técnica padronizada. A pesquisa de anticorpos circulantes anti-P. brasiliensis empregando-se o ensaio de imunodifusão      dupla, revelou que 34% apresentaram reatividade e 66% ausência de reatividade para P. brasiliensis. Por outro lado,  através da metodologia padronizada de Dot-blot observou-se o reconhecimento de anticorpos séricos anti-P. brasiliensis   em 47,3% e ausência de reatividade em 52,7%. Comparando a capacidade discriminatória de ambas as metodologias,   pode-se sugerir que o DB apresenta uma tendência de elevar o padrão de reatividade, uma vez que reconheceu 40      (13,3%) soros a mais que a ID. Ao comparar os resultados dos dois testes, considerando a ID o teste padrão ouro, foram  observados valores de copositividade e co-negatividade de 68,3% e 96,8%, respectivamente. E obtendo um índice de  concordância entre elas de κ=0,66, classificada como boa. A análise da estabilidade das membranas de nitrocelulose   dotadas com o antígeno de P. brasiliensis demonstrou que membranas armazenadas bloqueadas, independentemente da temperatura de armazenamento, não apresentaram padrão de reatividade como o observado em membranas  armazenadas não bloqueadas. Melhores resultados e padrão de reatividade foram visualizados em membranas dotadas e armazenadas à temperatura ambiente, por até 90 dias. A repetitividade intermediária também apresentou resultados     satisfatórios, já que apenas três amostras de soro, das 11 escolhidas aleatoriamente para o estudo, obtiveram resultados  diferentes entre os quatro analistas distintos que realizaram a técnica de Dot-blot. Os resultados obtidos, além de      demonstrarem que a técnica é de fácil execução, menor custo e tempo para a liberação de seu resultado, nos permite  sugerir um novo algorítimo para o diagnóstico sorológico da PCM, substituindo a metodologia de ELISA indireto  proposta para a realização da triagem sorológica pelo ensaio de Dot-Blot.