Obtenção de peptídeos bioativos (criptídeos) pela ação da tripsina e serinoproteases do veneno de Bothrops jararaca sobre substratos endógenos

Resumen

 As serinoproteases e metaloproteases são as principais enzimas do veneno de Bothrops jararaca, elas  agem sobre as proteínas dos tecidos das vítimas ou presas, e como resultado de suas ações diretas,  essas proteases podem gerar peptídeos com ações específicas em células ou ainda afetar mecanismos  fisiológicos. As fontes mais comuns de peptídeos bioativos são as proteínas precursoras naturais. No  entanto, estudos recentes têm mostrado que existem outras fontes de peptídeos bioativos, as cripteínas,  que fazem parte de uma nova classe de proteínas que não são consideradas precursoras, mas sob  certas condições, originam peptídeos bioativos, assim eles são denominados criptídeos. Os criptídeos  podem provocar efeitos relevantes na questão do envenenamento, causando efeitos secundários ou  indiretos. Neste trabalho, esses criptídeos gerados pela ação das serinoproteases do veneno e pela  ação da tripsina sobre substratos endógenos foram isolados e, em seguida, foram caracterizados  bioquimicamente e biologicamente de acordo com suas ações em células. As serinoproteases  do veneno de B. jararaca foram separadas do veneno total utilizando CLAE com uma coluna de  exclusão molecular, estas serinoproteases foram então incubadas com o substrato mioglobina. Como  também utilizou-se a tripsina, foram escolhidos os seguintes substratos: mioglobina, hemoglobina,  immunoglobulina G e colágeno, que foram incubados com a tripsina. Os criptídeos gerados foram  separados por fracionamento por CLAE e as frações testadas em culturas de células para observar  efeitos citotóxicos ou proliferativos. As frações ativas foram repurificadas para obter criptídeos puros.  Com a atividade desses criptídeos confirmada, estes foram sequenciados e sintetizados. A ação da  tripsina sobre a mioglobina gerou criptídeos (ALELFR, TGHPETLEK, GLSDGEWQQVLNVWGK)  que apresentaram atividade proliferativa em células do tipo fibroblastos e endoteliais. Utilizando um  programa de bioinformática, Cn3D, observou-se que os criptídeos gerados pela hidrólise da mioglobina  com a tripsina estão localizados na parte externa da proteína íntegra. Também foram encontradas  frações bioativas depois da incubação dos outros substratos, mencionados acima, utilizando a  tripsina, mas não foi possível sequenciá-los. A incubação da mioglobina com as serinoproteases  isoladas do veneno de B. jararaca gerou um cromatograma similar ao obtido com a incubação da  tripsina, mostrando que estas serinoproteases possivelmente gerem criptídeos que podem ter efeitos  secundários não neutralizados por soroterapia. Este estudo sugere que as serinoproteases do veneno  de Bothrops jararaca podem gerar criptídeos com efeitos relevantes por meio de suas ações nas  proteínas (substratos) que estão altamente disponíveis no local da picada.