Estudo da avidez de anticorpos IgG por Immunoblotting e Dot-Blot: comparação dos antígenos de OMVs e bactérias integras de meningococo em membrana de nitrocelulose

Abstract

A avidez é um critério crucial para avaliar a resposta imune, pois revela a capacidade funcional dos anticorpos. Embora o ELISA modificado seja comumente utilizado para avaliar a avidez de anticorpos, ele não permite a identificação dos antígenos específicos que estão fortemente ligados aos anticorpos. Para contornar essa limitação, adaptamos os testes de Immunobloting e Dot-Blot para ensaio de avidez In-house. Vesículas de membrana externa (OMVs) ou suspensão de bactérias íntegras inativadas (Whole Cells) foram transferidas para membranas de nitrocelulose, às quais também foi aplicada a proteína em seu estado nativo. As fitas foram incubadas overnight com um pool de soros (1^a, 2^a e 3^a dose) de camundongos imunizados com OMVs de Neisseria meningitidis e adjuvante hidróxido de alumínio. Adicionamos tiocianato de potássio (KSCN) 1,5 M antes da aplicação do anticorpo anti-IgG e incubamos à temperatura ambiente por 20 minutos. A análise do teste foi realizada qualitativamente, pela visualização da intensidade de coloração das bandas. Como esperado, o ensaio com Whole Cells permitiu o reconhecimento de mais antígenos em comparação com as OMVs. Em ambos os ensaios, a partir da 2ª dose foi possível avaliar a maturação de resposta de anticorpos IgG presentes no soro que levou ao reconhecimento de um maior número de antígenos e verificar também uma forte ligação destes anticorpos a antígenos de médio a alto peso molecular (46-245 kDa). Considerando o Dot-Blot, foi confirmada a presença de anticorpos com alta força de ligação. O estudo demonstrou que utilizar diferentes preparações da bactéria pode ser vantajoso para análise de um maior número de antígenos. Integrar o Immunoblotting e o Dot-Blot em um único ensaio economiza tempo e recursos, possibilitando uma avaliação qualitativa de diferentes estados do antígeno, fornecendo dados mais abrangentes para pesquisas sobre imunização contra esse patógeno.