Padronização de duas metodologias rápidas para verificação da ausência de micoplasmas em culturas celulares

Abstract

Os micoplasmas são um grupo de bactérias muito pequenas (aproximadamente 0,2 μm), que não apresentam parede celular, não causam turvação do meio de cultura e pertencem à classe Mollicutes. Devido a essas particularidades, podem contaminar facilmente as linhagens celulares, permanecendo despercebidos enquanto alteram suas características e comprometem os resultados obtidos com elas, motivo pelo qual são considerados um grande vilão. Este risco de contaminação é eliminado com a utilização de técnicas assépticas rigorosas em todas as etapas de manutenção das culturas, além de realizar testes para comprovar sua ausência. O Núcleo de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz (NCC-IAL) verifica periodicamente a ausência de micoplasmas de suas linhagens por PCR em tempo real, em colaboração com o Laboratório Estratégico do IAL. Porém, as normas internacionais recomendam a utilização de mais de um ensaio, devido às limitações inerentes de cada um. O objetivo desse trabalho foi padronizar e implantar dois métodos rápidos para essa finalidade na sua rotina, o da coloração fluorescente por Hoechst e o de bioluminescência. Na coloração por Hoechst foi utilizada a linhagem Vero, como indicadora, facilitando a visualização de micoplasmas, como pequenos pontos fluorescentes entre os núcleos celulares, mesmo com baixo nível de contaminação. Esse teste requer uma cultura comprovadamente contaminada, usada como controle positivo. Já a técnica de bioluminescênia é realizada com auxílio de um luminômetro e o kit MycoAlert, disponível comercialmente. Esse ensaio tem a vantagem de possuir um controle positivo livre de micoplasmas vivos, dispensando a necessidade de manipular uma cultura contaminada no laboratório, além de fornecer resultado imediato. Essas metodologias garantem a comprovação da ausência de micoplasmas no acervo do NCC-IAL, o que é essencial para uma coleção de linhagens celulares.