Crescimento primário e isolamento de tripanossomatídeos em sistemas de microcultivos

Abstract

Para o crescimento primário e isolamento de protozoários da família Trypanosomatidae em cultura são conhecidas várias formulações. Utiliza se meio bifásico contendo uma base de ágar e sangue desfibrinado para a fase sólida, pode ser NNN ou BAB e como fase líquida MEM ou Schneider ou 199 ou RPMI 1640 ou BHI. A adição de soro fetal bovino inativado ou urina humana estéril como fator de crescimento. O uso de antibióticos tem a finalidade de inibir contaminação bacteriana. No presente estudo foi avaliado o microcultivo em placas de 96 poços para o crescimento primário e o isolamento de tripanossomatídeos. Em microplacas de 96 poços com tampa e capacidade de 300 µL por poço, foi distribuído 150 µL de BAB preparado com sangue de coelho ou carneiro ou cavalo. Após a solidificação desse gel, as microplacas foram fechadas e mantidas em geladeira até o momento de uso. Foi preparado caldo BHI, acrescido de 300 µg/mL de gentamicina e 5% de urina humana estéril. Foram testados: I. Cepas de referência de Leishmania (L.) infantum, L. (L.). amazonensis, L.(L.) major, L.(V.) braziliensis, semeadas em diferentes concentrações dos inóculos obtidos por diluições seriadas, desde 10e3 até 10e1 e 10e0 parasitos; II. Amostras de aspirado de baço de cães com leishmaniose visceral; III. Sangue de camundongos inoculados com Trypanosoma cruzi, cepas silvestres; IV. Biópsia de fígado de paciente com hepatoesplenomegalia, posteriormente confirmada com infecção natural por Crithidia fasciculata. Não foi observada diferença significativa para o tipo de sangue utilizado, coelho ou carneiro ou cavalo, para a produção do meio sólido BAB. Mesmo para cultivos iniciados com menos de 10 parasitos por inóculo, foram observadas proliferações equivalentes a 10e5 e até 10e7. O sistema de microcultivo apresenta vantagens importantes quando utilizada para fins diagnósticos ou obtenção de massa parasitária para identificação e caracterização do tripanossomatídeo isolado.